PCR Primer Design - Wie erstellt man Primer für die PCR?

Autoren

Dr. Serge Thal

Zusammenfassung

Um eine PCR (Polymerasen Ketten-Reaktion) zur Vervielfältigung von DNA-Fragmenten durchzuführen, benötigt man "Primer", welche als Startsignal für die Polymerase dienen. Damit diese Reaktion spezifisch für ein spezielles DNA Fragment ist, dürfen diese Primer nur auf eine DNA binden. Für eine optimale PCR Reaktion müssen die Primer darüber hinaus noch andere Eingenschaften besitzen.

Bevor eine PCR bzw. real-time PCR durchgeführt wird, müssen zuerst spezifische Primer gesucht werden, welches spezifisch für das gesuchte Gene Produkt sind. Ohne funktionierende Primer, d.h. Primer, welche nur die gesuchte cDNA und dsDNA spezifisch und mit ausreichender Effizienz amplifizieren, sind die weiteren Schritte einer PCR sinnlos.

Wie findet man man "gute" Primer?

1.) Man läßt sich von KollegInnen funktionierende Primer Sequenzen geben.
2.) Man bittet eine/n KollegIn ein Design zu erstellen oder beauftragt eine Firma (z.b. TIB Molbiol, etc.) mit dem Design. Diese bietet sich an, wenn man nicht eine konventionelle PCR oder real-time PCR mit SYBR Green macht, sondern mit Sonden arbeiten möchte (HybProbe, Taqman, etc.).
3.) Man designed sich selber Sonden

Im folgenden möchten wir darauf eingehen, wie man Primer Sequenzen selber - eingenständig findet bzw. erstellt.

Materialien

Reagenzien:

• keine

Geräte:

• Computer mit Internetzugang

Durchführung

Wichtige Design-Kriterien

1. Primers should encompass an intron to see any genomic contamination.
2. One of the primers should reside on the intron exon boundry, (most of the primer length should reside on the 5' exon to prevent mispriming...)
3. A GC clamp should be present on the 3' most end of the primer to prevent mispriming.
4. The amplicon size is recomended to be between 100-300 bp.

Primer Design

1. Go to the Entrez Gene database.
2. Find the REFSEQ of your gene.
3. Get the refseq cDNA of your gene...
    * There is a link to the REFSEQ db from the ENTREZ GENE entry of the gene...something like NM_XXX....
    * Click FASTA format sequence of the REFSEQ cDNA,
    * Save the line starting with a greater than ( > ) sign as the identifier of your sequence...

4. Go to BLAT ( genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat )
5. Get the genomic sequence which corresponds to your gene by pasting your cDNA sequence in to BLAT and clicking submit.
6. Then just click find primers on perl primer, after pasting the genomic and cDNA sequences of the gene.
7. Finally, after you select your primers check the products which might be produced by these primers by epcr tool of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/e-pcr/reverse.cgi). Read the help of that tool if it is first time...
    * Enter your primers in 4 column format in REVERSE STS search tool: Four-column format, exactly one STS per line, columns are: label for sts, left primer, right primer, and product size (can be two dash-separated numbers for range of sizes).

Record primer information with at least the following information in an excel file for future use!!
    * Primer name (Gene symbol, primer number(should be unique in the lab), F or R, e.g: ACTB1F, ACTB2R)
    * Target gene
    * Primer sequence
    * TM of primer
    * Unique accession number of the sequence from which primer is designed. (gi number of NCBI is a good option, do not use gene accession numbers or gene symbols, they do not identify a sequence, sequence information for genes are always changing!!!)
    * Length of the primer

Kritische Schritte

folgt

Fehlersuche

folgt

Danksagung

folgt

Referenzen

• http://perlprimer.sourceforge.net/

Spezielle Protokolle

keine

Diskussion

keine