DNA-freie RNA Lösungen

Autoren

Dr. Serge Thal

Zusammenfassung

Um die aus Gewebe oder Zellen gewonnene RNA zu quantifizieren verwendet man häufig die PCR-Technik, bei zuerst die RNA in cDNA umgeschrieben wird und dann die cDNA mit Hilfe der Polymerasen Kettenreaktion vervielfältigt wird. Das Problem dieser Technik ist, daß eine Kontamination mit genomischer DNA das Ergebnis der PCR verfälschen kann, falls die Primer nicht RNA-spezifisch designed wurden (siehe Primer Design) oder das Zielgen nicht genügend Exon-Intro Übergänge bietet.

Bei den gängigen RNA Extraktonstechniken resultiert häufig eine mehr oder weniger geringe Verunreinigung mit genomischer DNA. Diese genomische DNA kann man mit Hilfe z.B. der PCR Technik nachweisen und mit Hilfe von DNasen eliminieren.

In dieser kurzen Anleitung soll beschrieben werden, wie man 1. DNA Verunreinigungen nachweisen kann und 2. diese DNA Verunreinigungen entfernen kann.

Materialien

Reagenzien:

• Primer (DNA spezifisch und intron-spanning)
• PCR Reaktionslösung
• ggf. Materialien für Gel-Elektrophorese
• DNase I

Geräte:

• PCR System (konv. Thermocycler oder real-time PCR System)
• Routine DNA/RNA Geräte

Durchführung

1. Nachweis von DNA Kontamination

Es existieren verschiedene Möglichkeiten DNA-Verunreinigungen nachzuweisen.

A. Klassische PCR mit RNA Lösung und intron-spanning Primern mit anschießender Gel-Elektrophorese zum Nachweis von Banden mit entsprechender Länge

B. real-time PCR mit RNA Lösung und intron-spanning Primern. ggf. Verifizierung der Bandenlänge mit Gel-Elektrophorese.

Beispiel Protokoll für Technik A (klassische PCR):

x

Kritische Schritte

folgt

Fehlersuche

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Danksagung

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Referenzen

• S. C. Thal, S. Wyschkon, D. Pieter, K. Engelhard, and C. Werner. Selection of endogenous control genes for normalization of gene expression analysis after experimental brain trauma in mice. J Neurotrauma, 25(7):785–794, 2008.

Spezielle Protokolle

folgt

Diskussion

keine